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仪表网 仪表标准】为贯彻《中华人民共和国环境保护法》，规范生态环境监测工作，生态环境部现批准《水质 灭菌生物指示物(枯草芽孢杆菌黑色变种)的鉴定 生物学检测法》标准为国家生态环境标准，并予发布。本标准自2022年4月1日起实施。
为贯彻《中华人民共和国环境保护法》《中华人民共和国水污染防治法》，防治生态环境污染，改善生态环境质量，规范水中灭菌生物指示物(枯草芽孢杆菌黑色变种)的鉴定方法，制定本标准。
本标准为首次发布。本标准规定了鉴定水中灭菌生物指示物(枯草芽孢杆菌黑色变种)的生物学方法，用于微生物实验室灭菌效果的评价。
本标准引用了下列文件或其中的条款。凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本标准。凡是未注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本标准。《消毒技术规范》(原卫生部卫法监发〔2002〕282 号)。
方法原理：
经灭菌处置后含枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢的水样通过孔径为 0.45 μm 的滤膜过滤，细菌和芽孢被截留在滤膜上，然后将滤膜置于酪氨酸琼脂培养基上，36 ℃±1 ℃培养 72 h～96 h，枯草芽孢杆菌黑色变种产生的酪氨酸酶可分解并利用酪氨酸形成黑色素，产生黑色的特征菌落。对特征菌落进行染色镜检后通过生化试验做进一步鉴定，能利用甘油和甘露糖，可还原硝酸盐和水解淀粉，不能利用苦杏仁苷和甘露醇，并确认为革兰氏阳性芽孢杆菌的特征菌落为枯草芽孢杆菌黑色变种，鉴定结果为阳性。
仪器和设备：
1. 样品瓶：螺口带盖或磨口具塞的 250 ml、500 ml 广口玻璃瓶。
3. 高压蒸汽灭菌器：121 ℃，可调。
4. pH 计：准确到 0.1 pH 单位或更高精度。也可使用 pH 精密试纸。
5. 显微镜：物镜 4×或 5×、10×、20×、40×，油镜 100×，目镜 10×或 15×。
6. 分析天平：实际分度值 0.0001 g。
7. 培养皿：直径 90 mm。
8. 过滤装置：配有砂芯滤器、圆筒形玻璃漏斗和真空泵，抽滤压力不低于-50 kPa。
9. 接种环：直径 1 mm～3 mm。
10. 镊子：不锈钢或一次性无菌塑料镊子。
11. 刻度移液管：1 ml、10 ml。也可使用可调式移液器。
12. 量筒：100 ml。 6.13 锥形瓶：100 ml。 6.14 酒精灯。
15. 试管：10 ml。 6.16 无菌操作设备：无菌室、超净工作台、生物安全柜。
17. 一般实验室常用仪器和设备。
样品采集：
评价使用高温高压灭菌设备的灭菌效果时，取样品瓶，加入枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢悬液及 200 ml 无菌水使混合液中枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢终浓度达到 5×104 CFU/ml～ 5×105 CFU/ml。灭菌处置完毕后，取出样品瓶，对水样进行灭菌生物指示物(枯草芽孢杆菌黑色变种)的检测。
评价使用其它灭菌设备的灭菌效果时，灭菌前取适量枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢悬液加入灭菌设备，使水样中枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢终浓度达到 5×104 CFU/ml～5×105 CFU/ml。灭菌处置完毕后，从灭菌设备中采集水样，进行灭菌生物指示物(枯草芽孢杆菌黑色变种)的检测。采样量一般为样品瓶容量的 80%左右，不得用样品洗涤样品瓶。样品采集完毕后，迅速用无菌包装纸包扎样品瓶。
本标准适用于微生物实验室灭菌效果的评价。
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